Genetske bolesti su i dalje globalni izazov, jer su uzrokovane mutacijama gena koje utiču na biološke funkcije, metaboličke procese ili proizvodnju određenih esencijalnih proteina pojedinaca, do različitih nasljednih poremećaja. Lijekovi za gensku terapiju su vrsta terapijske intervencije koja cilja specifične gene, s ciljem da ih popravi ili modificira, i da daju nova uputstva stanicama da proizvode funkcionalne proteine ili interveniraju u genskim defektima koji uzrokuju bolesti.
Uobičajeni genski lijekovi uglavnom uključuju DNK i RNK, pri čemu DNK mogu biti fragmenti gena ili genske sekvence s terapeutskim efektima. Ova DNK se isporučuje u ćelije kako bi zamijenila ili dopunila defektne ili nedostajuće funkcije gena. RNK može biti glasnička RNA (mRNA), mala interferirajuća RNA (siRNA) ili antisens oligonukleotidi (ASO), itd., koji se mogu koristiti za modificiranje, inhibiranje ekspresije štetnih gena ili obnavljanje funkcije specifičnih gena.
Međutim, i DNK i RNK se suočavaju s mnogim izazovima od ulaska u ljudsko tijelo do dostizanja ciljnih stanica. Budući da su sekvence gena nestabilne u gastrointestinalnom traktu, obično se daju intravenskom ili potkožnom injekcijom, ali čak i tako, većina genskih sekvenci se još uvijek razgrađuje od strane obilnih nukleaza u ljudskom tijelu.
Kada mala količina zaostalih genskih lijekova dospije do vanjske strane ciljnih stanica, oni ne mogu ući u ćelije jer su genske sekvence velike molekule s fosfatnim grupama koje nose negativne naboje, dok ćelijske membrane također nose negativne naboje. Kada se sretnu dva negativna naboja, geni se odbijaju i ne mogu ući u ćelije. Stoga, moramo razviti specifične metode isporuke genskih lijekova kako bismo spriječili njihovu degradaciju in vivo i poboljšali efikasnost prodiranja kroz ćelijsku membranu, te nesmetano isporučili sekvence DNK ili RNK do stanica.
Metode isporuke genskih lijekova
Trenutne uobičajene metode isporuke gena uglavnom su podijeljene u dvije kategorije: dostava virusnih vektora i ne-isporuka virusnih vektora. Dostava virusnih vektora uglavnom uključuje adeno-asociran virus (AAV) i lentivirus, itd., koji mogu simulirati proces virusne infekcije ćelija domaćina i lako preći ćelijske barijere, čime se postiže visoka efikasnost isporuke. Međutim, isporuka virusnih vektora takođe ima problema: prvo, ima ograničen kapacitet pakovanja, kao što je maksimalni kapacitet pakovanja AAV-a 4,7 kb, što ne može da isporuči duže sekvence gena; drugo, virusni vektori mogu izazvati ozbiljne imunološke reakcije, uključujući ćelijski imunitet i humoralni imunitet, što predstavlja rizik za kliničku primjenu. U poređenju s tim, ne-virusni vektori imaju velike prednosti u sigurnosti i kapacitetu punjenja lijeka.
Trenutni najčešće korišteni ne-virusni vektori uglavnom uključuju liposome, polimere, nanočestice, egzozome, itd., među kojima su liposomi vezikule formirane od amfifilnih molekula s promjerom u rasponu od 100nm do 1um. Uglavnom se sastoje od fosfolipida, holesterola, PEG lipida i kationskih lipida. Dvoslojna fosfolipidna struktura je slična ćelijskoj membrani i može nesmetano ući u ćelije putem endocitoze. Osim toga, liposomi također mogu modificirati PEG ili specifična antitijela na svojim površinama kako bi izbjegli imunološki klirens tijela dok ciljaju određena tkiva ili ćelije. Kationski liposomi su liposomi koji sadrže pozitivno nabijene lipide kvaternarne amonijumove soli, koji se mogu bolje vezati s negativno nabijenim lijekovima nukleinske kiseline i održavati stabilnost sistema isporuke. Stoga su liposomi jedna od uobičajenih metoda za isporuku genskih lijekova koji nisu -virusni vektori.
Međutim, tradicionalni liposomi također imaju neke probleme: prije svega, zbog velikog raspona promjera liposoma, iako to može osigurati dovoljan kapacitet punjenja lijeka, kada liposomi prođu kroz vaskularni endotelni jaz (100-200nm), prevelika veličina će ometati ovaj proces. Osim toga, nakon što liposomi uđu u ćelije putem endocitoze i formiraju endosomsko-lizosomski sistem, tradicionalni liposomi ne mogu na vrijeme dovršiti bijeg iz lizosoma, što dovodi do toga da većina genskih lijekova razgrađuje lizozomi i ne mogu ispoljiti svoje efekte. Na osnovu ovih nedostataka tradicionalnih liposoma u isporuci genskih lijekova, razvijene su lipidne nanočestice (LNP) koje su postale važna metoda isporuke, posebno pogodna za isporuku nukleinskih kiselina u ciljne stanice i tkiva.
Uvod u LNP Carrier System
Lipidne nanočestice (LNP) su nanočestice koje se sastoje od supstanci sličnih lipidima-i promjera općenito između 10-200 nm. U poređenju sa tradicionalnim liposomima, oni su manji i lakše prolaze kroz vaskularne endotelne praznine. Osim toga, LNP se obično sastoji od kationskih/jonizujućih lipida, pomoćnih fosfolipida, lipida polietilen glikola (PEG) i holesterola. Među njima, pomoćni fosfolipidi i holesterol mogu povećati stabilnost LNP; PEG lipidi pomažu povećati vrijeme cirkulacije LNP in vivo i smanjuju imunološke reakcije. Ove komponente imaju slične funkcije kao i tradicionalni liposomi. Razlika je u kationskim/jonizujućim lipidima, koji su takođe glavna oblast patentne zaštite za LNP.
Kao što je ranije pomenuto, kationski liposomi mogu efikasno održavati vezivanje sa lekovima nukleinske kiseline i poboljšati efikasnost isporuke lekova nukleinske kiseline. Međutim, kationski liposomi su također skloni ne-specifičnom vezivanju s negativno nabijenim proteinima plazme, krvnim stanicama, itd. u tjelesnoj cirkulaciji, što uzrokuje agregaciju liposoma i brzo se uklanja iz tijela (poluživot-kationskih liposoma in vivo je samo 15 minuta).
Kako bi riješili ovaj problem, istraživači su razvili novu vrstu lipidnog materijala koji se zove jonizujući lipidi. Jonizujući lipidi po strukturi su vrlo slični kationskim lipidima. Uzimajući uobičajeni kationski lipidni DOTAP i jonizujući lipidni DODAP kao primjere, razlika je u tome što je DOTAP kvaternarna amonijumova so sa pozitivnim nabojem, dok je DODAP tercijarna aminska struktura. Struktura tercijarnog amina može zadržati pKa lipida između 6-7. Kada je pH niži od pKa (u kiselim uslovima), jonizujući lipidi su pozitivno nabijeni.
Kada je pH blizu pKa (u neutralnim uslovima), jonizujući lipidi su neutralni. Ovaj dizajn može pametno riješiti problem s kojim se susreću kationski liposomi: budući da je pH u cirkulaciji blizu neutralnog, jonizujući lipidi su također neutralni, a ne-specifično vezivanje između njih i proteina plazme ili krvnih stanica je značajno smanjeno, produžavajući poluživot-. Osim toga, kada se jonizujući lipidni LNP preuzimaju od strane stanica i ulaze u lizosome, lipidi se joniziraju i pozitivno nabijaju u lizozomalnom okruženju s pH 5-6. Pozitivno nabijeni lipidi se lako spajaju s membranom endosoma-lizozoma, omogućavajući liposomima da pobjegnu u citoplazmu, disociraju i oslobađaju nukleinske kiseline, ispoljavajući tako svoje djelovanje. Ukratko, dizajniranje LNP sistema nosača uključuje optimizaciju sastava lipida, veličine čestica, površinskog naboja i stabilnosti kako bi se postigla efikasna isporuka gena.
LCMS strategija bioanalize za LNP{0}}pakovane genske lijekove
LNP-upakovani genski lijekovi se uglavnom sastoje od LNP ljuske i samog genskog lijeka. LNP školjka se uglavnom sastoji od lipidnih komponenti (katjonski/jonizabilni lipidi čine oko 30-50%, PEG lipidi oko 2%, holesterol oko 20-50%, pomoćni fosfolipidi oko 10-20%), dok se genski lijekovi uglavnom sastoje od fragmenata genske sekvence A, siRNA, miRNA itd.). Prema najnovijim propisima NMPA i FDA[14-15], za IND primjenu lijekova sistema za isporuku lijekova kao što je LNP, pored provođenja farmakoloških i farmakokinetičkih studija o aktivnom sastojku (slijedu gena), potrebna je i sigurnost i farmaceutska procjena za nove komponente lipida koje se nisu koristile u sistemu za isporuku lijekova/lijekovi koji se prodaju na tržištu, kao što su lijekovi koji se prodaju na tržištu, kao što su PEG. lipidi sa posebnim modifikacijama u LNP.
LCMS bioanaliza LNP lipida fokusira se na kationske/jonizujuće lipide i PEG lipide. Zbog strukturnih razlika između njih, kationska/jonizujuća molekularna težina lipida je općenito unutar 1 kDa, dok molekularna težina PEG lipida može doseći 2~5 kDa nakon nošenja modifikacionih grupa, što rezultira velikim razlikama u hromatografskom zadržavanju i reakciji masene spektrometrije između njih. S obzirom da je sadržaj kationskog/jonizujućeg lipida u LNP-u veći od sadržaja PEG lipida, razlika u odgovoru dovodi do nemogućnosti efektivnog objedinjavanja metoda prethodnog tretmana (izbor rastvarača za ekstrakciju, određivanje faktora razblaženja) oba. Pored toga, zbog prisustva mnogih interferirajućih pikova oko položaja vrha PEG lipida, duži gradijent odvajanja tečne faze je često potreban za efikasno odvajanje, što ne može garantovati visoku efikasnost analize. Stoga smo posebno uspostavili metodu detekcije PEG lipida u bioanalizi. U isto vrijeme, kationski/jonizujući lipid i PEG lipid također imaju uobičajene poteškoće u razvoju metode zbog svojih lipidnih komponenti, kao što su slaba rastvorljivost u vodi, nestabilnost u biološkoj matrici, vezivanje proteina za oporavak prekoračenje granice, visoka interferencija i ostatak PEG lipida, promjena stabilnosti lipida u stvarnom internom standardu matrixa.
